Metagenômica: entenda o método utilizado para confirmação do primeiro caso de varíola dos macacos no Brasil 

Flávia Almeida

Marcelo Mimica

12/07/2022

Atualizado em05/07/2022

3 min

Varíola dos macacos

O Instituto Adolfo Lutz confirmou o primeiro caso no país em 09 de junho de 2022. Como o RT-PCR para a detecção do vírus ainda não está disponível no Brasil, o diagnóstico foi feito com utilização da metodologia de metagenômica. O Laboratório Estratégico do Instituto Adolfo Lutz depositou a primeira sequência do genoma completo do Monkeypox virus do Brasil. A sequência depositada no banco de dados GISAID sob o n° EPI_ISL_13191438 possui cobertura de quase 100% do genoma do vírus, e permitirá a realização de estudos para estabelecer os caminhos da doença no mundo, assim como a observação da evolução genética do agente. 



Microbiologia clínica

Antes de entendermos os pressupostos teóricos e práticos da metagenômica, faz-se importante uma breve introdução sobre as áreas de atuação da microbiologia frente ao rastreamento dos patógenos. Dito isso, vamos nos ater ao campo da microbiologia clínica, que compreende tanto a microbiologia diagnóstica (identificação de patógenos a partir de amostras clínicas para orientar o manejo e estratégias de tratamento para pacientes com infecção), quanto a microbiologia de saúde pública, com vigilância e monitoramento de surtos de doenças infecciosas na comunidade.



Diagnóstico em microbiologia

Técnicas tradicionais de diagnóstico, em microbiologia, incluem:


  • Crescimento e isolamento de microrganismos em cultura; 
  • Sorologia; 
  • Métodos antigênicos; 
  • Identificação molecular, mais frequentemente por reação em cadeia pela polimerase (PCR). 



FIgura 1. Amostra para PCR.

Enquanto a maioria dos ensaios moleculares visa apenas um número limitado de patógenos usando primers ou sondas específicas, as abordagens metagenômicas caracterizam todo DNA ou RNA presente em uma amostra, permitindo a análise de todo o microbioma, bem como o genoma do hospedeiro humano ou transcriptoma em amostras de pacientes. 



Metagenômica

A metagenômica tem sido utilizada há décadas para caracterizar vários nichos, que vão desde ambientes marinhos, microbioma humano até aplicações forenses.

A metagenômica viral tem sido utilizada quando o estudo avalia o genoma de todos os vírus existentes em amostras ambientais (exemplos: água de lagos, água de reuso) ou biológicas (exemplos: aspirados do trato respiratório, fezes humanas e de outros animais), nas quais se pressupõe presença de grande diversidade de vírus. Essa abordagem metagenômica também é utilizada para a identificação do genoma de um provável vírus responsável por uma doença específica e/ou pelo efeito citopático em cultura de células, principalmente quando técnicas usuais não estão disponíveis ou não conseguiram detectá-lo.




Metagenômica viral

A análise metagenômica viral compreende as seguintes etapas:


  • Coleta da amostra clínica;
  • Purificação e concentração das partículas virais (ou do ácido nucleico viral, se existir a possibilidade de o vírus estar na forma latente ou integrado ao genoma do hospedeiro); 
  • Extração de ácidos nucleicos; 
  • Transcrição reversa de RNA para cDNA, quando necessário; 
  • Amplificação randômica dos segmentos genômicos; 
  • Análise dos dados;
  • Sequenciamento dos fragmentos de ácidos nucleicos e análise das sequências com métodos de bioinformática. 


O sequenciamento desses fragmentos pode ser feito pela técnica de Sanger, após clonagem ou, como tem sido feito mais recentemente, em plataformas de sequenciamento de nova geração (NGS); 


A figura abaixo ilustra como é feita a metagenômica.

Figura 2. Ilustração de análise metagenômica. Fonte: Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019 Jun;20(6):341-355.




O que é importante saber

É fundamental ressaltar que apesar da metagenômica contribuir para o aumento do número de vírus descobertos, a compreensão do número de novas associações de vírus a doenças não tem ocorrido na mesma proporção. A associação causal depende não só do encontro do vírus em um paciente doente, mas da completa investigação da relação vírus-doença. A presença do vírus em uma amostra, durante a fase aguda de uma infecção, não o torna necessariamente agente responsável pela doença. Pode representar apenas a detecção de um vírus que tenha excreção prolongada, sem que esteja ocorrendo, por exemplo, replicação, vírus ou fragmentos virais não-viáveis, ou até um vírus que seja parte do viram humano sem causar infecção/doença.




Considerações finais

A metagenômica viral tem mostrado grande impacto na identificação e descoberta de novos vírus, pelas suas características de possibilitar a detecção de todos os genomas virais presentes em uma amostra, e por independer de testes imunológicos, de conhecimento prévio do genoma viral (diferentemente de outras técnicas de biologia molecular como PCR, microarray e hibridização in situ) e de isolamento em cultura de células. A relação de causalidade entre um vírus e uma doença no homem e outros animais, no entanto, continua dependendo de um conjunto de investigações clínicas, epidemiológicas e laboratoriais, do uso de critérios estritos para associá-los, como os postulados de Koch e os que dele advieram, e do bom senso dos pesquisadores ao analisar esses dados.




Referências

1.   Castrignano SB, Nagasse-Sugahara TK. The metagenomic approach and causality in virology. Rev Saude Publica. 2015;49:21. 

2.   Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019 Jun;20(6):341-355.





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Flávia Almeida

Infectologia

CRM: 91434-SP

Médica formada pela Universidade de Mogi das Cruzes, com residência em Pediatria e Infectologia Pediátrica pela Santa Casa de São Paulo, doutorado pela Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. Professora assistente de Pediatria da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. Médica assistente da Infectologia Pediátrica do Departamento de Pediatria da Santa Casa de São Paulo.

Marcelo Mimica

Pediatria, Infectologia Pediátrica, Patologia Clínica/Medicina Laboratorial

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